Исследования физиологического состояния взрослых особей камчатского краба путем регистрации интенсивности дыхания и кардиоактивности
В настоящее время инструментальные методы измерения физиологических изменений в тех или иных организмах находят все большее применение при решении широкого круга задач. С их помощью исследуются особенности физиологических реакций животных на условия окружающей среды. К одним из наиболее информативных методов контроля за физиологическим состоянием организма в искусственных условиях можно отнести динамику интенсиности дыхания (ИД) и кардиоактивности.
Интенсивность дыхания (Respiration intensity). Интенсивность дыхания оценивали по потреблению кислорода в расчете на один час и один килограмм массы краба в респирометре объемом 150 л (рис. 8.4). Концентрацию кислорода измеряли термооксиметром HANNA, модели НI 9145, позволяющем одновременно регистрировать температуру, или универсальным оксиметром YSI-85.
" +
Рис. 8.4. Респирометр Fig.
В первом эксперименте исследовали влияние температуры на половозрелого самца камчатского краба массой 3670 г и шириной карапакса 179 мм. Интенсивность дыхания измеряли при температуре 7, 9, 11 и 13 С, по три повторности для каждого значения. 13 С — является верхней границей физиологического оптимума для взрослых особей камчатского краба. Продолжительность каждого опыта составляла 6 часов, в течение которых каждые 30 минут регистрировали температуру и концентрацию кислорода. Затем были рассчитаны средние величины потребления кислорода для каждой температуры. OHM cocTaBMJIM IIpM 7 "C — 30,4 MT/Kr*qac, IIpM 9 "C — 32,5 ????? IIp M 11 °C — 34,8 MIT/Kr* 'Iac, a IIp M 13 °C — 47,6 MT/Kr* Hac (pMc. 8.5).
Рис. 8.5. Зависимость потребления кислорода камчатским крабом от температуры воды
Во втором эксперименте была изучена интенсивность дыхания переди после имитации транспортировки (ИД измеряли в течение 3,5 ч. каждые 15 мин.), заключавшейся в помещении крабов на 24 часа в герметичный охлаждаемый контейнер без воды. Средняя интенсивность дыхания крабадостресса, имитирующего транспортировку, соcTaBJI5HJIa 54,4 MT/KIr*vHac (41,4—60,9) (pMc. 8.6).
Первые 15 минут после «транспортировки» ИД была крайне низкая — 4,9 мг/кгйчас, но в последующие два часа рассматриваемый показатель плавно поднимался до 34,1 мг/кг*час, и на протяжении последующих 1,5 часов существенно не менялся (см. рис. 8.6). Через сутки после «транспортировки» потребление кислорода вернулось к норме, достигнув 55,3 мг/кг*час.
Рис. 8.6. Интенсивность дыхания камчатского краба до и после имитации 24-часовой транспортировки
По разнице потребления кислорода до и после транспортировки,
а также по скорости и характеру нормализации дыхания во время повторного измерения, можно судить об успехе транспортировки, и, как следствие, об эффективности того или иного способа перевозки.
B третьем эксперименте исследовали влияние линьки на интен
сивность дыхания. Нами отмечено существенное снижение ИД крабов перед началом линьки, полное прекращение потребления кислорода в момент освобождения от старого панциря и последующее резкое увеличение (рис. 8.7).
Рис. 8.7. Изменения интенсивности дыхания промысловых самцов камчатского краба в процессе линьки
Fig. 8.7. Variations in respiration intensity of fishable red king crab males during molting
Полученные нами данные по интенсивности дыхания при разной температуре, после транспортировки «насухую» и линьки могут быть использованы в целях контроля за физиологическим состоянием камчатского краба при оптимизации биотехники его культивирования.
Кардиоактивность. Одним из методов, позволяющих определять физиологические показатели деятельности сердечно-сосудистой системы (CCC) животных, является метод фотоплетизмографии (ФПГ), основанный на регистрации пульсовых кривых. Метод имеет ряд преимуществ перед электрокардиографией, реографией и др., а именно: - возможность работы в условиях повышенной влажности окружающей среды;
- отсутствие электрических воздействий на биологический объект; - возможность регистрации без сдавливания сосудов, что не нарушает кровообращения.
Суть метода ФПГ заключается в следующем. Исследуемые ткани биологического объекта просвечиваются пучком инфракрасного (ИК) излучения с помощью источника, которое, частично проходя через ткань или частично отражаясь от ее внутренних слоев, воспринимается фотоприемниками. Пульсации периферических сосудов вызывают колебания оптической плотности живой ткани, поэтому поток ИК-излучения модулируется по амплитуде и наводит в фотоприемнике пропорциональный потоку электрический сигнал. Таким образом, фотоплетизмограф позволяет вести неинвазивную запись пульсаций кровенaпoлнeния сосудов, на основании обработки которых появляется возможность проводить диагностику физиологического состояHIM3H OpITaHIM3Ma.
Поскольку данный метод применяется на камчатском крабе впервые, мы позволим себе более подробно остановиться на методической части. Вариационная пульсометрия (ВП) является одной из возможностей использования ФПГ-метода. ВП успешно применяется в космической медицине для оценок акклимации, «уровня здоровья» условно здоровых людей — космонавтов, и динамики изменения их функционального состояния при тестировании в периоды отбора, предполетной подготовки и работы на орбите (Баевский, Берсенева, 1997). С.В. Холодкевичем с соавторами (2007) и лабораторией эксперименTaJIHHori a KoJIoTMM BoJIHEIx cMcTeM HML10B PAH (T. CaHKT-IIeTepoypr) был разработан оригинальный волоконно-оптический биоэлектронный метод отведения кардиоактивности бентосных беспозвоночных с жестким наружным покровом, позволяющий непрерывно в реальном времени осуществлять дистанционный неинвазивный контроль их физиологического состояния. Авторами разработаны блок-схема установки для регистрации кардиоактивности гидробионтов и программное обеспечение, необходимое для математической обработки выборки кардиоритмов и получения необходимых для дальнейшего анализа параметров ВП (Холодкевич, 2007; Холодкевич и др., 2007).
Метод прошел aпробацию на речных раках, морских и пресноводных моллюсках при решении экологических и экотоксикологических задач, связанных с мониторингом качества природных и очищенных сточных вод (Холодкевич и др., 2007; Холодкевич, 2007; Kholodkevich et al., 2007).
Статистические характеристики динамического ряда кардиоинтервалов включают: частоту пульса, среднее квадратичное отклонение, коэффициент вариации. Кроме указанных «классических» статистических показателей вычисляются четыре дополнительных. Для этого формируется новый динамический ряд числовых величин — значений разностей между каждым предыдущим и последующим кардиоинтервалами. Получая ряд разностных значений, удается элиминировать постоянную составляющую динамического ряда и все медленные колебания. Расчет основных параметров вариабельности включает в себя следующие показатели:
- ЧСС (HR) определяется как количество NN-интервалов в записи, деленное на продолжительность их записи:
HR = 60 - 1000 - " - (B 1 / MMH);
NIN (Mc) i=1
- RIMSSD - среднеквадратичная разностная характеристика (root mean sum successful devitlon) pacci MTBIBaeTcs IIo dbopMy Jie:
1. n-1 2 RMSSD = » (NN –NN 1)" (Mc);
\(n - 1) i
- PNN50 — процентное отношение NN-интервалов, разностные характеристики которых (x-x 1 ,)>50 мс, к общему количеству NN-интервалов.
Геометрические методы основаны на построении гистограммы (вариационной пульсограммы) с шагом 50 мс (0,05 с), начиная от 0,3 до 1,7 с. Таким образом, получается 28 диапазонов значений функции x(t), каждый из которых имеет ширину 50 мс. Ординаты диапазонов гистограммы определяются как отношение количества элементов х дискретных значений NN-интервалов, попавших в диапазон к общему количеству элементов — N (в %). Мода (Мо) определяется как наиболее часто встречающееся в данном динамическом ряде значение кардиоинтервала. В физиологическом смысле — это наиболее вероятный уровень функционирования сердечно-сосудистой системы. При нормальном распределении и высокой стационарности исследуемого процесса, Мо мало отличается от математического ожидания.
По вариационной пульсограмме определяются следующие показаTe:JIKI:
- амплитуда моды (AMо) как значение ординаты гистограммы в %, соответствующее моде (Мо); амплитуда моды — это число кардиоинтервалов, соответствующих значению моды, выраженное в процентах к объему выборки; Мо отражает стабилизирующий эффект централизации управления ритмом сердца, который обусловлен, в основном, степенью активации симпатического отдела вегетативной нервной системы;
- вариационный размах (MxDMn) является разницей между наименьшим и наибольшим значениями динамического ряда R-R интерBaOB:
MxDMn = x - x
BAIX min (Mc)
- стресс-индекс (индекс напряжения регуляторных систем — SI) вычисляется путем деления амплитуды моды на удвоенное произведение моды на размах.
В настоящей работе впервые, с помощью адаптированного для беспозвоночных метода вариационной пульсометрии, проведены исследования динамики изменения сердечной деятельности промысловых самцов камчатского краба в процессе и после различных, наиболее часто встречающихся при культивировании стрессорных воздействий: кормление, «хэндлинг», транспортировка и др. Исследования кардиоактивности проводятся во ВНИРО совместно с лабораторией экспериментальной экологии водных систем НИЦЭБ РАН (г. СанктПетербург) с мая 2007 г.
До начала опытов крабов, доставленных в лабораторию не более чем через 12 часов после отлова в Баренцевом море, в течение 10— 15 дней акклимировали в лабораторных акватронах и изотермических емкостях аквариального модуля лаборатории воспроизводства ракообразных с искусственной морской водой, температурой воды — 5 С, соленостью — 32%o (рис. 8.8).
Перед помещением крабов в акватроны, на их панцирь (в области проекции сердца) приклеивали миниатюрное «седло», в которое вставляли волоконно-оптический датчик для регистрации кардиоактивности. Волокно последовательно присоединяется к 7-канальному фотоплетизмографу, с которого сигнал через аналого-цифровой преобразователь поступает на компьютер, где обрабатывается специальным программным обеспечением (рис.8.9).
Фотоплетизмограф содержит следующие узлы: фотоэлектрические датчики, включающие в себя источник (светодиод) и приемник (фотодиод). ИК-излучения, усилители сигналов фотодатчиков, микроконтроллер с выходным каналом RS-232C для связи с ПЭВМ, в состав которого входит аналого-цифровой преобразователь (АЦП). Сигналы семи датчиков, установленных на обследуемых биологических
объектах, после усиления поступают на входы АЦП микроконтроллера, который с определенной частотой дискретизации преобразует каждый из пяти сигналов в цифровой код и передает в ПЭВМ.
Типичные тренды частоты сердечных сокращений (ЧСС) и стрессиндекса камчатского краба в процессе приема пищи представлены на рис. 8.10. Стрелками на графиках указаны моменты подачи корма, после чего краб сразу же начинал питаться. После начала приема пищи наблюдалась активизация кардиоактивности краба: резкий рост ЧСС на 10—15 ударов в минуту. При этом, средние значения стрессиндекса увеличились более чем на 500 условных единиц. Такое увеличение свидетельствует об изменении физиологического состояния крабов при приеме пищи, которое должно учитываться в целях оптимизации биотехники культивирования.
Рис. 8.10. Изменения ЧСС и стресс-индекса камчатского краба в процессе приема пищи
Второй эксперимент был поставлен с целью оценить по кардиоактивности силу стресса от транспортировки и скорость адаптации к аквариальным условиям ВНИРО. Первые дни после транспортировки из Мурманска и помещения в установки с замкнутым водоснабжением, ЧСС крабов составляла 50—60 сокращений/мин, что превышает показатели стресса при приеме пищи (см. рис. 8.10). В течение последующих двух недель рассматриваемый показатель снижался до 30—35 сокращений/мин. Начиная с четвертой недели, среднесуточный показатель ЧСС составлял 18—25 сокращений/мин (рис. 8.11), что близко к норме (см. рис. 8.10).
Реакцию крабанахэндлингоценивали в эксперименте помоделированию транспортировки (рис. 8.12 А, Б), для чего особей переносили в емкости для транспортировки и выдерживали в течение 5,5 часовбез воды.
Fig. 8.12. Setting up recording of red king crab heart rate: A - in the water, B - in the transportation tank (VNIRO)
Реакция на хэндлинг и содержание без воды имела сильно выраженный характер: ЧСС возрастала на 50—70%, достигая после первогохэндлинга 40 сокращений/мин, а после содержания на воздухе и повторного хэндлинга — 50 сокращений/мин. Характерно, что впе
риод имитации транспортировки ЧСС находилась почти в норме, составляя 30—35 сокращений/мин. После «транспортировки» в течение 5,5 час ЧСС была несколько ниже, чем после 12-часовой реальной транспортировки (рис. 8.11, 8. 13 А). В течение 20 час после завершения имитации транспортировки ЧСС уменьшалась, но к норме так и не возвращалась, поскольку восстановление занимает около 3-х недель (см. рис. 8.11).
Рис. 8.13. Изменения ЧСС (А) и стресс-индекса (Б) камчатского краба при «хэндлинге» в модельном эксперименте по транспортировке
Fig. 8.13. Changes in heart rate frequency (A) and stress-index (B) in red king Crab during handling in pilot transportation
Динамика стресс-индекса была иной. После первого хэндлинга в течение 2 час стресс-индекс снизился до значений, близких к норме (см. рис. 8.10). Затем, в течение последующих 3 ч выдерживания без воды стресс-индекс сначала возрос до 1150 усл. ед., затем начал плавно снижаться, достигнув перед повторным хэндлингом 500 усл. ед. (такая же степень реакции на прием пищи). После перенесения крабов в аквариумы стресс-индекс продолжал снижаться еще в течение 2 ч, вновь достигнув нормы. После чего произошло резкое увеличение величины рассматриваемого показателя в отдельных случаях до 2000—2500 усл. ед. Последующие 20 ч происходило плавное снижение стресс-индекса, величина которого к концу эксперимента снизилась до значений менее 500 усл. ед. (рис. 8.13 Б), но так и не достигла нормы (см. рис. 8.10).
По-видимому, стресс-индекс наглядно демонстрирует триаду Г. Селье (1960), когда стрессорное воздействие вызывает снижение реакции, затем — резкое возрастание и лишь потом физиологические реакции постепенно приходят в норму.
Количественная оценка стресса путем измерения кардиоактивности методами фотоплетизмографии позволяет с высокой точностью оценивать степень воздействия тех или иных факторов среды, включая биотехнические приемы, на физиологическое состояние камчатского краба. Получаемые данным биоэлектронным методом результаты могут быть использованы для оптимизации технологии воспроизводства, содержания и дорацивания камчатского краба.
Смотрите также
